在我們所熟悉的基本色譜分離方程式中，分離度R和柱效（N）、選擇因子（a）以及容量因子k'相關(guān)，和柱壓無關(guān)。 但柱壓（P）仍不失為 HPLC方法中的最重要參數(shù)之一，因?yàn)橹鶋悍从沉松V柱的內(nèi)部狀況。
現(xiàn)今能承受400 bar壓力的HPLC泵很常見，色譜柱如在遠(yuǎn)低于上限的壓力下正常運(yùn)行，不需要我們重點(diǎn)關(guān)注；當(dāng)柱壓升高接近上限或者柱壓有異常升高，往往意味著色譜柱出狀況了，需及時進(jìn)行維護(hù)和補(bǔ)救，嚴(yán)重時色譜柱就已報廢了。本節(jié)將詳細(xì)考察柱壓問題并提出可行的解決方案。
柱壓方程
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對填充色譜柱，柱壓與黏度 (η)、柱長 (L)和流速 (F)成正比，與填料粒徑（d p）以及柱管半徑（r）的平方成反比。K0是比滲透性系數(shù)，對填充床，其值約為0.001。通過此公式可近似計算出給定色譜條件下的理論柱壓。只有當(dāng)新柱實(shí)際測得的柱壓和理論柱壓相差很大，才能說柱壓存在問題。
黏度 (η)取決于流動相溶劑的選擇，為降低柱壓，反相色譜中傾向于選擇低黏度的乙腈，而不是高黏度的異丙醇。當(dāng)然選擇時還需考慮溶劑強(qiáng)度、極性、分析物的溶解度以及和分析物兼容性等。 柱長（L）增加可以提高分離度（R），流速（F）提高能加快分離，但都會導(dǎo)致柱壓上升，選擇確定這些運(yùn)行參數(shù)時，需綜合平衡和折中。
填料粒徑對柱壓影響極大，d p降低一倍，柱壓將增加4倍。UHPLC中采用的sub-2 μm填料，柱壓超過普通HPLC泵的400Bar上限很多。提高柱溫因可降低黏度η，相應(yīng)降低柱壓。在梯度洗脫時，黏度隨流動相組成的變化而改變，柱壓也會處在不斷變化中。對水/甲醇流動相體系，在55：45時，黏度和柱壓有個極大值。
內(nèi)徑的影響同樣很大，根據(jù)線流速相同柱壓相同的原則，4.6mm內(nèi)徑的色譜柱流速為1ml/min，約相當(dāng)于在2.1mm內(nèi)徑色譜柱上的0.2ml/min流速，在10mm半制備色譜柱上的5ml/min，計算公式為v＝1.0ml/min x（內(nèi)徑r/4.6）2。所以在換不同內(nèi)徑色譜柱時，請及時調(diào)整流速，以免因高柱壓損傷色譜系統(tǒng)。
柱壓下降是儀器系統(tǒng)的連接有泄漏，柱壓不穩(wěn)定一般認(rèn)為是流路中有氣泡或空穴，和色譜柱相關(guān)的柱壓問題是柱壓上升。
色譜柱結(jié)構(gòu):
圖1. Compress型不銹鋼色譜柱的基本構(gòu)造
圖2. Modular Column基本構(gòu)造
和柱壓相關(guān)最大的是進(jìn)口端篩板（inlet frit）以及其后面1-50px長度的柱頭填料。篩板上有比填料粒徑小的小孔，篩板上的小孔或柱頭填料的間隙被部分堵塞，是柱壓上升的主要原因。有以下幾類情況：
1. 填料破碎和使用后有填料粉末生成
填料破碎一般在裝柱過程中發(fā)生，裝柱壓力過大或所選硅膠機(jī)械強(qiáng)度過低所至，設(shè)定柱壓出廠標(biāo)準(zhǔn)可解決；流動相中高pH值緩沖鹽使硅膠溶解并重新形成填料粉末，堵塞出口端篩板，這種情況下反沖不起作用，只有更換后篩板，不過打開承壓的后篩板，對柱床會有不好影響。
2. 顆粒物堵塞引起柱壓上升和對策
可能堵塞進(jìn)口端篩板（前篩板）和柱頭填料間隙的顆粒物來源有：樣品（制樣時灰塵和濾紙等帶入）、進(jìn)樣閥密封圈磨損、流動相（溶劑本身含有和配制過程進(jìn)入）、液相儀器中泵閥密封圈的磨損、緩沖鹽析出（一般在梯度運(yùn)行和進(jìn)樣時鹽的溶劑環(huán)境改變導(dǎo)致）。
水和緩沖鹽流動相內(nèi)生長的細(xì)菌，也是顆粒物來源的一種，可堵塞篩板和填料間隙。應(yīng)避免將這類流動相在室溫下久放，可放入冰箱存放。
1) 預(yù)防措施
樣品（甚至標(biāo)準(zhǔn)品）和流動相過濾，既預(yù)防了篩板、柱頭和毛細(xì)管堵塞，又能減少進(jìn)樣閥、活塞桿和截止閥等儀器關(guān)鍵部件的磨損。普通用0.45um孔徑濾膜過濾樣品和流動相，對使用2um以下填料的超高壓柱的，可用0.20um濾膜。濾膜材質(zhì)有再生纖維素、聚四氟乙烯、尼龍、硝酸纖維和醋酸纖維等，須根據(jù)和樣品溶劑及分析物的適應(yīng)性慎重選擇。
使用保護(hù)柱或在線過濾器，具體安裝位置見下圖：
在線過濾器內(nèi)裝有可更換的濾片，濾片孔徑一般有2um和0.5um兩種。安裝位置有兩個可選擇，在進(jìn)樣器和色譜柱之間時，對樣品和流動相中的顆粒物都有效；在泵和進(jìn)樣器之間，則只對流動相有過濾作用。
保護(hù)柱是縮小版的色譜柱，內(nèi)含帶填料的可更換的柱芯，安裝在進(jìn)樣閥和色譜柱之間，用于防止色譜柱的化學(xué)污染為主，也有過濾顆粒物的作用。
2) 故障排除
反沖色譜柱：不連接檢測器，直接將堵在前篩板上的顆粒物沖出排到廢液瓶中。開始時反沖壓力可低于正常使用壓力，待顆粒物有沖出后，逐步提高沖洗壓力。有時顆粒物已非常牢固嵌入到篩板內(nèi)部，反沖不一定湊效，早反沖、勤反沖相對效果更好。有的廠商為避免堵塞，使用了較大孔徑（2-5um）的前篩板，這種情況反沖會將填料沖出。
換篩板：一般不建議這樣做，因?yàn)閾Q篩板會帶走粘在篩板上的部分填料，使柱床的均一性受影響，導(dǎo)致柱效下降。不過如果反沖不能解決問題，也只能不得已而為之，要不然就要把色譜柱報廢了。
如果系統(tǒng)中不接色譜柱，柱壓仍然高，說明泵出口到色譜柱之間的其它部位，包括進(jìn)樣器、在線過濾器和保護(hù)柱等有堵塞，可逐一排查。為了減少死體積，毛細(xì)管都做得盡可能的細(xì)，也可能被堵。
3. 化學(xué)污染物引起柱壓上升和對策
來源同樣是樣品、流動相和系統(tǒng)，不過來源于樣品的污染最普遍，特別是對復(fù)雜基體樣品未經(jīng)前處理或前處理不夠的時候?；瘜W(xué)污染物主要有：分子量很大的化合物、鹽類、脂質(zhì)、蠟類、油脂、腐殖酸、蛋白質(zhì)等其它生物來源的物質(zhì)。
像鹽類這樣的保留能力極小的污染物會在死體積處很快從柱中洗脫出去，檢測器一般對此類物質(zhì)響應(yīng)不大，有時表現(xiàn)為干擾峰、基線波動、斑點(diǎn)甚至負(fù)峰。
保留能力中等的污染物，會被慢慢洗出色譜柱，表現(xiàn)為寬峰、基線饅頭形波動和基線緩慢漂移。
對強(qiáng)保留的污染物，一般流動相強(qiáng)度不足以將其從柱中洗出，會逐步在柱頭累積。有時，累積在柱頭的污染物可作為新固定相對分析物起作用，引起保留時間改變、峰拖尾和峰分叉等。污染物在柱頭累積到一定程度，如果不采取措施，會堵塞填料間隙，引起柱壓上升。最好的辦法是選用合適的溶劑沖洗溶解這些物質(zhì)，同時又不對填料本身有損害。如聚合物柱中累積的蛋白類污染物可用pH13-14的強(qiáng)堿溶液洗掉，但這種方法不適合硅膠基質(zhì)色譜柱。
1） 預(yù)防措施：
a．制樣時采用SPE固相萃取等方法，預(yù)先將色譜柱殺手類的污染物質(zhì)清除掉；
b．連接保護(hù)柱。保護(hù)柱是分析柱的延伸，在填料類型和粒徑上應(yīng)于分析柱一致，才能最大限度起保護(hù)作用，又不影響色譜性能。一個設(shè)計和裝填良好的保護(hù)柱，還可增加分析柱的分離效率。如果因某種原因需在保護(hù)柱中用不同的填料，也應(yīng)選擇比其所保護(hù)的分析柱保留能力弱的固定相，這時的保護(hù)柱完全用于截住強(qiáng)保留物質(zhì)，類似于SPE小柱的功效。當(dāng)保護(hù)柱柱芯保護(hù)功能用盡時，也不能說不可再清洗后復(fù)用，但價格低不值得去花這個時間。
C．經(jīng)常對分析柱進(jìn)行沖洗維護(hù)：
2） 故障排除：
已經(jīng)累積很多污染物，用甲醇或乙腈簡單沖洗不奏效，推薦使用下面方法清洗反相柱
100％甲醇---100％乙晴---75％乙晴/25％異丙醇---100％異丙醇---100％二氯甲烷---100％正己烷
用每種溶劑沖洗至少10個柱體積，對于250mm×4.6mm的分析柱，合適的沖洗流速是1～2ml/min。最后用10柱體積的異丙醇過渡，然后回到原來的流動相體系。
對受蛋白類污染的硅膠基質(zhì)反相柱，純有機(jī)溶劑如乙腈或甲醇不能溶解多肽和蛋白質(zhì)。由有機(jī)溶劑、緩沖液和酸,有時還加上離子對試劑等組成的配方清洗效果極佳，譬如用三氟乙酸水溶液和三氟乙酸/丙醇溶液對柱子重復(fù)進(jìn)行梯度洗來再生；Bhadwaj和Day試驗(yàn)了在250mm×46mm的柱子中注入100μL的三氟乙醇，再生效果良好。
清洗硅膠、CN和Diol等正相柱建議方法：先用20柱體積50：50正己烷/氯仿沖洗，然后用甲醇、二氯甲烷或者100%醋酸乙酯沖洗。對油脂類物質(zhì)，可用異丙醇清洗。
